【獸藥名稱】
通用名 禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
商品名 無
英文名 Avian Influenza Virus H5 Subtype RT-PCR Detection kit
漢語拼音 Qinliugan Bingdu H5yaxing RT-PCR Jianceshijihe
【主要成分與含量】
變性液6mL×1瓶、酚/氯仿/異戊醇混合液6mL×1瓶、異丙醇9mL×1瓶、75%乙醇10mL×2瓶、DEPC水500μl×1管、2mol/L醋酸鈉溶液（pH值4.0）700μl×1管、陽性對照100μl×1管、陰性對照100μl×1管、RT-PCR反應體系22.5μl×22管、6倍上樣緩沖液 100μl×1管、擴增對照30μl×1管。
【作用與用途】
用于H5亞型禽流感病毒的檢測。適用于可能感染H5亞型禽流感病毒的咽喉拭子、泄殖腔拭子、組織、雞胚尿囊液以及細胞培養物中H5亞型禽流感病毒RNA的檢測。
【用法與判定】
1 取1.5mL DEPC處理過的離心管，加入待檢樣品100μl,加300μl變性液，繼續加入30μl 2mol/L醋酸鈉（pH值4.0）。反復顛倒離心管4~5次，以混合均勻。
2 加入酚/氯仿/異戊醇混合液300μl,反復顛倒離心管3~5次，再搖晃10秒，置冰上靜置15分鐘。
3 4℃ 12000r/min離心20分鐘，吸取上清置另一個離心管中。
4 加入等體積的異丙醇，-20℃靜置10~15分鐘，沉淀RNA.
5 4℃ 12000r/min離心10分鐘。棄上清，加入75%的冰乙醇，溫和地反復顛倒離心管3~5次。
6 4℃ 12000r/min離心5分鐘。棄上清，用濾紙吸干管壁余液，真空抽干或者37℃烘干5~20分鐘。
7 加入10μl DEPC水，溶解RNA.
8 取2.5μl RNA轉移到RT-PCR反應體系管中。
9 置于PCR儀中，循環參數為45℃逆轉錄45分鐘，94℃ 預變性2分鐘，94℃ 30秒、52℃ 45秒、68℃ 45秒，35個循環，68℃延伸8分鐘。
10 取5μl PCR產物，混合1μl 上樣緩沖液，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。以DNA分子量Marker為參考。
11 結果判定，同時出現372bp和229bp大小的擴增片段時，判定為H5血凝素亞型禽流感病毒陽性，只出現229bp片段判定為其它亞型A型流感病毒陽性，只出現372bp定為H5亞型疑似，不出條帶，判定為陰性。
【注意事項】
（1）本試劑盒RNA提取液2~8℃存放；RT-PCR反應體系-20℃以下存放。盡量不要反復凍融。
（2）RT-PCR反應體系，用前要先在冰上徹底溶化，并瞬時離心將液體甩至管底。
（3）病料的處理很重要，現地采集的病料，先進行研磨，再按照每克重量加入1mL PBS,混勻，按10-1~10-2比例稀釋后用于RNA的提取。棉拭子病料直接加入1mL PBS,混合后取溶液用于RNA的提取，不需要稀釋。
（4）RNA的提取直接會影響到RT-PCR結果，需要特別注意RNA提取過程的操作。
（5）注意廢棄物的無害化處理。可疑待檢樣品及其接觸過器材要消毒滅菌，防止實驗室散毒；含有EB的物品需要高溫處理。
（6）注意防止PCR操作過程中的環境污染，有條件情況下可以采用獨立房間分別進行RNA提取、RT-PCR、電泳等操作環節，無條件時應該盡可能劃分不同功能的工作區，并且電泳時采用單獨移液器。
【廢棄包裝處理措施】
剩余的試劑及空瓶不能隨意丟棄，須經加熱或消毒滅菌后方可廢棄。
【規格】
20份/盒。
【貯藏與有效期】
RNA提取試劑置2~8℃保存；RT-PCR反應體系置-20℃以下保存。有效期6個月。
【批準文號】
獸藥生字（2006）080018075
【生產企業】
哈爾濱維科生物技術開發公司